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cDNA文库
[原理]：
cDNA文库不同于基因组文库，被克隆 DNA 是从 mRNA 反转录来源的 DNA。CDNA 组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做 cDNA 克隆时应是先从获得 mRNA 开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与 mRNA 相互补的 DNA 链，然后除掉 mRNA，以第一条DNA 链为模板复制出第二条 DNA 链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建
分为六个阶段：
阶段 1：反转录酶催化合成cDNA 第一链
阶段 2：cDNA 第二链的合成
阶段 3：cDNA 的甲基化
阶段4：接头或衔接子的连接
阶段 5：Sepharose CL-4B 凝胶过滤法分离cDNA
阶段 6：cDNA 与 λ 噬菌体臂的连接
[阶段 1：反转录酶催化合成cDNA 第一链]
1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行 cDNA 第一链的合成：
poly(A)+RNA
(1μg/μl) 10μl
寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl
(pH8.0, 37℃) 2.5μl
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2μl
dNTP溶液（含 4 种dNTP，每种5mmol/L） 10μl
0.1 mol/L
DTT 2μl
RNase抑制剂（选用） 25单位
加 H2O 至 48μl
2．当所有反应组在 0℃混合后，取出2.5μl 反应液转移到另一个 0.5ml 微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α–32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录 8 所述方法，测定 0.5μl 小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的 DNA 分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
6．按下述方法计算 cDNA 第一链的合成量（推算方法略）：
[掺入的活度值 (cpm)/ 总活度值 ]×66(μg)= 合成的 cDNA 第一链(μg)
7．尽可能快地进行 cDNA 合成的下一步骤。
[阶段 2：cDNA 第二链的合成]
1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：
10 mmol/L MgCl2 70μl
2 mol/L
Tris-HCl (pH7.4) 5μl
10 mCi/ml[α–32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000单位/ml) 1μl
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I (10 000 单位/ml) 4.5μl
温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。
2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大肠杆菌 DNA 连接酶 (1000~4000 单位/ml) 1μl
室温温育15min。
3．温育结束，加入 1μl 含有 4 种dNTP的混合物和 2μl T4 噬菌体 DNA 聚合酶。反应混合物室温温育 15 分钟。
4．取出 3μl 反应物，按步骤 7 和8描述的方法测定第二链 DNA 的质量。
5．将5μl 0.5 mol/L
EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3
mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收 DNA，将DNA 溶解在 90μl TE(pH7.6) 溶液中。
6．将下列试剂加到 DNA 溶液中：
10×T4多核苷酸激酶缓冲液 10μl
T4多核苷酸激酶（3000单位/ml） 1μl
室温温育 15 分钟。
7．测定从上面步骤 4 取出的 3μl 反应物中放射性活度，并按分子克隆实验指南》第三版附录 8 所述方法测定 1μl 第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8．用下面公式计算第二链反应中所合成的 cDNA 量。要考虑到已掺入到 DNA 第一链种的 dNTP 的量。
[第二链反应中所掺入的活度值 (cpm)/ 总活度值 (cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA 第二链合成量/μg
x表示 cDNA 第一链量。CDNA第二链合成量通常为第一链量的70~80%
9．用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。
10． Sephadex G-50用含有 10 mmol/L NaCl 的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的 dNTP 和cDNA分开。
11． 加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.2）和 2 倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的 cDNA，将样品置于冰上至少15 分钟，然后在微量离心机上以最大速度 4℃离心15 分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。
12． 用 70% 乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13． 小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。
14． 如果需要用 EcoR I 甲基化酶对 cDNA 进行甲基化，可将 cDNA 溶解于 80μl TE(pH7.6) 溶液中。另外，如果要将 cDNA 直接与 Not I 或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将 cDNA 悬浮在29μl
TE(pH7.6)溶液。沉淀的 DNA 重新溶解后，尽快进行 cDNA 合成的下一步骤。
[阶段 3：cDNA 的甲基化]
1．在 cDNA 样品中加入以下试剂：
2 mol/L
Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 m
