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变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据 DNA 片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸 50% 发生变性时的温度称为熔解温度(Tm)。Tm值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度 50~
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}实验方法
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、实验原理
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据 DNA 片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸 50% 发生变性时的温度称为熔解温度(Tm)。Tm值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度 50~
为了提高 DGGE 的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区 ——GC 夹。GC夹(GC clamp)就是在一侧引物的 5′ 端加上一个 30~40bp 的GC结构,这样在 PCR 产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此,DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。
作为一种突变检测技术,DGGE具有如下的优点:(1)突变检出率高。DGGE的突变检出率为 99% 以上。(2)检测片段长度可达 1kb,尤其适用于100~500bp 的片段。(3)非同位素性。DGGE不需同位素掺入,可避免同位素污染及对人体造成的伤害。(4)操作简便、快速。DGGE一般在 24 小时内即可获得结果。(5)重复性好。但是,该方法需要特殊的仪器,而且合成带 GC 夹的引物也比较昂贵。
二、实验用品
1.PCR扩增仪;变性梯度凝胶电泳仪;凝胶成像及分析系统;紫外透射仪;高速离心机;电泳仪;电泳槽。
2.尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖
3.微量加样器(200μl,20μl);Tip头(200μl,20μl)。Tip头盒(200μl,20μl);Eppendorf管(0.5ml,0.2ml),Eppendorf管架。
4.PCR扩增相关试剂
三、实验步骤
1.PCR反应(同前)
其中,上游引物加40bp [GC]
Clamp。
2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。
3.垂直变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为 6% 聚丙烯酰胺凝胶,变性浓度为 0~100%。其中,含
PCR产物加上样缓冲液后上样,300~400μl/孔,电压 150V,温度
4.平行变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变。
PCR产物加上样缓冲液后,25μl~30μl/孔,电压 150V,温度
5.染色 5 分钟,凝胶成像仪分析结果。
四、注意事项
1、该实验中提取 DNA,以及DGGE 操作中接触到得很多药品都有毒,还有致癌、变性等毒害,一定要严格操作,做好防护保护自己。
2、严格按操作步骤。