基因定点突变

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基因定点突变

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

通过设计引物,并利用 PCR 将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的 PCR 产物,在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性 克隆,再测序确定就行了。

三、引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则:

1)通常引物长度为 25~45 bp,我们建议引物长度为30~35 bp 一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12bp才能与模板搭上,而这种突变 PCR 要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少 12bp,并且合成多一条反向互补的引物。

2)如果设定的引物长度为 30 bp,接下来需要计算引物的Tm 值,看是否达到 78GC 含量应大于40%)。

3)如果 Tm 值低于 78,则适当改变引物的长度以使其Tm 值达到 78GC 含量应大于40%)。

    4设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

    5最好使用经过纯化的引物。

      
Tm
值计算公式:Tm=0.41×(%
of GC)–675/L+81.5

注:L:引物碱基数;% of GC:引物 GC 含量。

四、引物设计实例

GCGACG 为例:

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

1)首先设计 30 bp 长的上下游引物,并将 A (T) 设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

2引物 GC 含量为 40%L30,将这两个数值带入 Tm 值计算公式,得到其 Tm=75.5Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通过计算可以看出其Tm 低于78,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。

3重新调整引物长度。

Primer #1: 5’CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加 5mer(斜体下划线处),这样引物的GC 含量为 45.7%L 值为 35,将这两个数值带入Tm 值计算公式,得到其 Tm80.952Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及Buffer

引物和质粒都准备好后,当然就是做 PCR 喽,不过对于 PCR 的酶和 buffer,不能用平时的,我们做PCR 把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个 K,所以要用那些GC buffer 或扩增长片段的 buffer,另外,要用保真性能较好的PFU 酶来扩增,防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒,如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的 金牌快速 taq 酶、TakaraPrimeSTARTM HS DNA polymerase

六、如何去掉 PCR 产物

最简单的方法就是用 DpnI 酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而 PCR 产物都是没有甲基化的,所以 DpnI 酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响 PCR 产物,从而去掉模板留下 PCR 产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。

七、如何拿到质粒

直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性 克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果。

八、图示

正文完

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