质粒DNA的提取

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一、原理

采用碱变性发抽提取质粒 DNA。该法是基于染色体DNA 与质粒 DNA 的变性预复性的差异而达到分离目的的。在 PH 大于 12 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以 pH5.2 的乙酸钠高盐缓冲液调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、方法

挑取一环在 LB 固体培养基平板上生长的含 PUC57 质粒的大肠杆菌，接在含有 100μg/ml 氨苄青霉素（Amp）的 LB 液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
将 1.5ml 菌液加入微离心管中，14000r/min，离心 10 秒，其取上清液。反复数次，收集全部菌体。
倾去上清，滤纸吸干。
加 30μlTE 缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
加 30μlTENS 溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS）,震荡 10 秒至溶液变粘稠。
加 150μl 3.0mol/LnaAC, 震荡 3—5S，14000r/min，离心3 分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心 2 分钟。
上层水相转移至另一位离心管，加 2 倍量冷水乙醇，14000r/min，离心 20 分钟。

9．倾去乙醇，加入7o%冷乙醇淋洗。

10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸 2～3 分钟。

lI．加人 50μlTE 缓冲液，溶解DNA。

12，加入 1μl 核糖核酸酶 (10mg/m1)，14000r/min, 离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。

13．37℃水浴30min。

14．样品放一20℃冰箱保存备用。

三、试剂

1．TE缓冲液(10mmol/L   Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0)

配制方法：

Tris        1.211g

EDTA.Na     0.037g

用 800ml 重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整 pH 至8.0，加重蒸水定容至1000ml。

2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)

    配制方法：

    NaOH    O.4 g

    SDS     0.5 g

加 80mlTE 缓冲液溶解。加 TE 缓冲液定容至lOOml.

3．3.0mol/1醋酸钠溶液(pH5.2)

配制方法：醋酸钠   24.6g

用 70ml 重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调 pH 至5.2,加重蒸水定容至100ml。

纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去能引起 DNA 和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于 65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol/L Tris-HCI(pH8.0) 缓冲液，立即加盖，激烈振荡，并加入固体 Tris 摇匀调 pH( 一般 100ml 苯酚约加 l 克固体 Tris) 分层后测上层水相 pH 至7.6一 8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol/L Tris-HCI(pH8．o) 覆盖在酚相上，置 4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．1%8 一羟基喹啉及o．2%β—巯基乙醇。

5．无水乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

6．70%乙醇

置-20℃冰箱中保存备用

7．核糖核酸酶(10mg/ml)

配制方法：称取 l0mg 核糖核酸酶 A(RNaseA，美国SIGMA 或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂 )。于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol/pH5.0 的NaAC溶液 ( 完全溶解 )，即为10mg/ml RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min 或100℃水浴 2 min，然后置一20℃( 或家用冰箱的冰格内 ) 保存。

四、材料

1．菌种：

大肠杆菌(pUC57)

2．培养基

LB液体培养基

精解蛋白胨 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化钠    3 g

葡萄糖    0.6g

    按上述配方用重蒸水 (ddH2O 或dH2O表示，下同 ) 溶解至 300ml。用10mol/LnaOH 调

pH至 7．2～7．4。分装于15ml 试管中，每支 5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg/cm² 灭菌20min.

l抗菌素：

氨苄青霉素 (Amp) 临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg/m1。

五、仪器：

恒温振荡器。

低温冰箱-20℃

真空泵。

台式高速离心机

六、说明

    1．质粒 DNA 提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯

梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理

和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体 DNA 的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐

等。

    2．在基因操作实验中．保存或提取 DNA 过程中，一般都采用 TE 缓冲液，而不选用其它

的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为 DNA 的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中，要用到 Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca²⁺ 产生 Ca(PO4+ 沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris—HCI 缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；作中的 EDTA 是二价离子

Mg²⁺、Ca²⁺等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅

助因子，所以 EDTA 可以抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用。

    3、TENS中 NaOH：核酸在pH 大于 5, 小于 9 的溶液中稳定，怛当 pH 大于 12 或小于3

时，就会引起 DNA 两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有 NaOH 使其 pH 大于12，因而

使染色体 DNA 与质粒 DNA 变性。

    TENS中的 SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与

蛋白质 , 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合

成为 R1 一O一 SO3…R₂⁺ 一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核

糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中 ( 用

Rnase去除 RNA 时)受干扰。

    4、3．0mol/L NaAC(pH5.2)使 pH 大于 12 的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA

能够复性，并能稳定存在。染色体 DNA 不能复性 ( 染色体 DNA 不存在超螺旋共价闭合环结构 ) 而高盐的 3mol/L NaAC 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合物凝聚沉淀。pH5．2 也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐能与

SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

    5．饱和酚：酚是一种表面变性剂，属非极性分子。水是极性分子。当蛋白质溶液与酚混合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心。变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，酚比重更大，保留在最下层。酚作为变性剂．也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约 10%～15%，溶解在这部分水相中有DNA 会损失，(2)酚很容易氧化，变成粉红色，氧化的酚容易降解 DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris—HCl 缓冲液饱和，使酚不至于夺去 DNA 中的水，带走部分 DNA。饱和酚中加上8 一羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由于有颜色．溶解在酚中后，使酚带上

颜色，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层 Tris 水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。

正文完