mRNA的分离纯化

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mRNA的分离纯化

【实验原理】

真核生物的 mRNA 分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是 mRNA 的翻译产物，因此，高质量 mRNA 的分离纯化是克隆基因、提高 cDNA 文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约 1×10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中 rRNA 为75%～ 85%，tRNA占 10%～16%，而mRNA 仅占 1%～5%，并且mRNA 分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。

         真核生物 mRNA 有特征性的结构，即具有 5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A) 尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的 3’端存在20~300 个腺苷酸组成的 poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA 分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。

        一般 mRNA 分离纯化的原理就是根据 mRNA 3’末端含有多poly(A) 尾巴结构特性设计的。当总 RNA 流经寡聚（dT）（即 oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 被特异地吸附在 oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次 oligo(dT) 纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。

        目前常用的 mRNA 的纯化方法有：

       （1）寡聚（dT）-纤维素柱层析法，即分离 mRNA 的标准方法；

       （2）寡聚（dT）-纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）-纤维素直接加入到总的   RNA 溶液中并使 mRNA 与寡聚（dT）-纤维素结合，离心收集寡聚（dT）-纤维素/mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）-纤维素；

        （3）其它一些方法：如寡聚（dT）-磁性球珠法等。

         本实验应用方法（1）进行 mRNA 的分离纯化。

【试剂与器材】

（一）试剂

1． 0.1mol/L NaOH ，每组200mL

2． 寡聚 Oligo（dT）– 纤维素

3． 加样 / 洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH
7.6)，每组250mL

或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1%
SDS。

4． 洗涤缓冲液 2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL 或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L
EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。

        配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS 至终浓度。

5． 5 mol/L NaCl，每组10mL

6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL

7． 无 RNase 双蒸水 (DEPC 水)，每组100mL

8． 70%乙醇，每组10mL

注意：溶液 5，6 的配制都应该加 0.1% DEPC 处理过夜，溶液 1，3，4，8 则用经 0.1% DEPC 处理过的无 RNase 双蒸水配制，Tris应选用无 RNase 的级别。溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如 10ml 或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。

（二）器材

1． 恒温水浴箱

2． 冷冻高速离心机

3． 紫外分光光度计

4． 巴斯德吸管

5． 玻璃棉

6． 5ml一次性注射器

【操作方法】

（一） oligo(dT)纤维素的预处理

1． 用 0.1mol/L NaOH 悬浮 0.5-1.0g oligo(dT) 纤维素。

2． 将悬浮液装入填有经 DEPC 水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为 0.5-1.0mL，用3 倍柱床体积的无 RNase 的灭菌双蒸水冲洗 oligo(dT) 纤维素。

3． 用 3-5 倍柱床洗涤缓冲液 I 冲洗 oligo(dT) 纤维素，直到流出液的 pH 值小于8.0。

4． 将处理好的 oligo(dT) 纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液 I 悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二）
总 RNA 浓度的调整

1． 把实验一所提的总 RNA 转到适合的离心管中，如果总 RNA 的浓度大于 0.55mg/mL，则用无RNase 的双蒸水稀释至 0.55mg/mL，总RNA 的浓度对除去 rRNA 是很重要的。把 RNA 溶液置于 65℃水浴加热5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。

2． 加入 1/10 体积 5 mol/L NaCl 使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

（三） mRNA的分离

1． mRNA与 Oligo(dT)- 纤维素结合：用移液器重新悬浮 oligo(dT)- 纤维素，按下表取适量的 oligo(dT)- 纤维素到 RNA 样品中，盖上盖子，颠倒数次将 oligo(dT)- 纤维素与 RNA 混匀。于 37℃水浴保温并温和摇荡15 分钟。