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Northern Blot原理及实验方法
原理 ：在变性条件下将待检的RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而 将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 RNA 探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：
[仪器、试剂、材料]
（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总 RNA 样品或 mRNA 样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜
（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer,
Sephadex G-50,SDS，双氧水 , 灭菌水等。
[方法与步骤]
1.用具的准备：
180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等 4 小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用 DEPC 水冲洗，干燥备用。处理 DEPC 水(2
L)备用。
2．用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用 DEPC 水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：
1． 称取 0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入 32.4mlDEPC 水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 ( 需加 DEPC 水补充蒸发的水分)
2． 在通风厨中加入 3.6ml 的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。
3． 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。
4．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入 1x MOPS Gel Running buffer 盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml 1×MOPS
Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）
5．检查点样孔。
4. RNA样品的制备
在 RNA 样品中加入 3 倍体积的 formaldehyde load dye 和适当的 EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃ 空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。
5.电泳：
1.将 RNA 样品小心加到点样孔中。
2.在 5V/cm 下跑胶（5x14cm）。在电泳过程中，每隔 30min 短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。
3.紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。
6.转膜
1．用 3% 双氧水浸泡真空转移仪后，用 DEPC 水冲洗。
2．用 RNAZap 擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用 DEPC 水冲洗二次。
3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的 5mm），膜在Transfer buffer 浸湿 5 分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。
4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。
5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。
6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。
7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer
buffer加到胶面和四周。每隔 10min 在胶面加上1ml
transfer buffer，真空转移 2 小时。
8．转膜后，用镊子夹住膜，于 1x MOPS Gel Running buffer 中轻轻泡洗 10 秒，去除残余的胶和盐。
9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于 UV 交联仪中自动交联。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
12．将膜在 -20℃ 保存。
7.探针的制备
1．在 1.5ml 离心管中配制以下反应液：模板DNA(25 ng) 1ul
Random Primer 2ul灭菌水 11ul 总体积：14ul
2．95°C加热 3 分钟后，迅速放置于冰冷却5min。
3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4．混匀后（25ul），37°C下反应 30 分钟。短暂离心，收集溶液到管底。
5．65°C加热 5min 使酶失活。
8.探针的纯化及比活性测定：
1．准备凝胶：将 1g 凝胶加入 30ml 的DEPC水中，浸泡过夜。用 DEPC 水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。
2．取 1ml 一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex
G-50凝胶。
3．将注射器放入一支 15ml 离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心 4 分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex
G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器 0.9ml 刻度处
4．100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心 4min。重复3 次。
5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的 1.5ml 离心管置于管中，再将装填了 Sephadex G-50 凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准 1.5ml 离心管。
6．将标记的 DNA 样品加入 25 ul STE，取出0.5ul 点样于 DE8 paper 上，其余上样于层析柱上。
7．1600g离心 4min，DNA 将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入 DNA 的dNTP则保留在层析柱中。取 0.5ul 己纯化的探针点样于DE8-paper.
8． 测比活性。
9．预杂交：
1．将预杂交液在杂交炉中 68℃ 预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。
2．加入适当的 ULRAhyb 到杂交管中 ( 以100cm2膜面积加入 10mlULRAhyb 杂交液 )，42℃ 预杂交4 hr。
10．探针变性：
1．用 10 mM EDTA 将探针稀释 10 倍。
2．90℃热处理稀释后探针 10min 后，立即放置于冰上5min。
3．短暂离心，将溶液收集到管底。
11．杂交：
1．加入 0.5ml ULTRAhyb 到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。
2．42℃杂交过夜（14~24hr）。杂交完后，将杂交液收集起来于-20℃保存。
12．洗膜：
1．低严紧性洗膜：加入 Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2 膜面积加入 20ml 洗膜溶液 )，室温下，摇动洗膜5min 两次。
2．高严紧性洗膜：加入 High Stringency Wash Solution#2 (100cm2 膜面积加入 20ml 洗膜溶液 )，42℃ 摇动洗膜 20min 两次。
13．曝光：
1． 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。
2． 检查膜上放射性强度，估计曝光时间
3． 将 X 光底片覆盖与膜上，曝光
4． 冲洗 X 光底片，扫描记录结果。
14．去除膜上的探针 ：将200ml 0.1%SDS（由DEPC 水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让 SDS 冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。
15．杂交结果
操作应该小心，但不必紧张。用于 RNA 电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去 RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡
