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QPCR 引物设计要点
一、 设计对象及分析目的
1. 分析对象则为设计对象；但具体的实验对象因具体的实验方法而异；
2. 表达水平分析（定量）：RNA(mRNA, lncRNA, rRNA, tRNA, miRNA, piRNA);
3. 存在分析（定性）：DNA (CHIP-QPCR), RNA (RIP-QPCR);
4. 等位基因拷贝数分析：DNA（LOH）;
5. 甲基化分析：重亚硫酸盐转化后的基因组 DNA 序列（可以假设 CpG 位点的 C 全部发生甲基化，或 CpG 位点的 C 全部未发生甲基化）；
6. 设计模板：序列号或具体的序列（见图 1）
二、 设计参数
以在线软件为例：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
1. PCR 产物的长度（PCR product size）：一般为 80-200bp，最好为：90-140 bp（图 2）；
2. 引物的退火温度（Primer melting temperatures, TM）：59-60℃，最优为 60℃（在实际进行 QPCR 反应时，TM 值为 60℃）（图 2）；
3. 跨外显子（span an exon-exon junction）：其中一条引物落在相邻两个外显子的交界上，其作用是避免所提取的总 RNA 污染了基因 DNA 所造成的假阳性（图 3），如果设计模板为基因组 DNA（重亚硫酸盐处理的 DNA 序列）则不需遵守；
4. 跨内含子（separated by at least one intron）：正反引物分别落在相邻的两个外显子上，其作用是避免所提取的总 RNA 污染了基因 DNA 所造成的假阳性（图 3），如果设计模板为基因组 DNA（重亚硫酸盐处理的 DNA 序列）则不需遵守；
5. BLAST 检索引物的特异性，根据设计对象的属性选择合适的数据库种类（图 4），输入检测样本的种属（图 5）；
6. 引物的要求：长度为 18-26bp，最优为 23bp, 引物的 GC 含量为 50-60%，引物中连续出现的相同碱基的数目不超过 4（图 6）；
7. 计算引物 TM 值的参数：QPCR 反应体系中的一价盐离子，二价盐离子，dNTP 的浓度和引物的浓度均可影响 TM 值（图 7）；
8. 引物尽量不含已知的 SNP 位点（图 8），否则存在出现碱基错配的风险；
正文完
