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石蜡切片是最基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法(简称 H.E. 对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过 HE 染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。
一、器材及试剂:
1. 器材:
切片刀,切片机,恒温箱,蜡杯,酒精灯,解剖刀,解剖剪,解剖盘,培养皿,镊子,单面刀片,毛笔,包埋盒,染色缸,盖玻片,载玻片,玻片盘,树胶,树胶瓶,显微镜,温度计,脸盆,水浴锅。
切片机,切片刀,温台,恒温箱,解剖刀,镊子,剪刀,解剖针,单面刀片,小台木,洒精灯,包埋纸盒,染色缸,烧杯,水盆,熔蜡炉,蜡杯。
中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液, 1%伊红酒精溶液,1%盐酸酒精溶液,甘油蛋白粘片剂,中性树胶。
卡诺(Carnoy)固定液,埃利希苏木精染液,1%伊红酒精溶液,1%盐酸 乙醇 液,各级酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,甘油蛋白粘片剂,中性树胶。
鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。
石蜡切片是最基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法(简称 H.E. 对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过 HE 染色,细胞核 被苏木素染成 蓝紫 色,细胞质 被伊红染色呈 粉红色。
1.中性甲醛固定液:
甲醛(37%-40%,市售,本所购买即为此浓度) 100mL
磷酸氢二钠 6.5
磷酸二氢钾(钠) 4g
双蒸水 900mL
2.苏木精、伊红染色液为碧云天产品
3.1%盐酸乙醇液
盐酸 1 份
70%酒精 100 份
4.甘油蛋白贴片剂:
蛋白 50 ml
甘油 50 ml
水杨酸钠(防腐剂)
配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中,去蛋黄留下蛋白,用玻棒调打成雪花状泡沫,然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中,经数小时或一夜,即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油,稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂(水杨酸钠)作防腐用。可保存几个月。
1.取材
颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取肝组织(或其他组织)。
切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以 5mm×5mm×2mm 或
注意事项:
(1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。
2.固定
将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下,立即投入中性福尔马林固定液中固定,固定30-50min。
注意事项:
(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。
(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的 20~30 倍,有些水分多的材料,中间应更换 1-2 次新液。
(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 洗涤
材料经固定后 , 流水冲洗,数小时或过夜。
4. 脱水
材料依次经 70%、80%、90% 各级乙醇溶液脱水,各 30min,再放入95%、100% 各2次,每次20min。各
注意事项:
(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。
(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。
(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。
(5)如需过夜,应停留在 70% 酒精中。
(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象
5.透明
纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明为止)。
由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。
透明注意事项
(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。
(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。
(3)在透明过程中,如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。
6.透蜡
放入二甲苯和石蜡各半的混合液 15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60 分钟。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。
透蜡注意事项
(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;
(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;
(3)操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
7. 包埋
包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热,夹取材料将切面朝下放入蜡模中,排列整齐。再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。
8. 切片
①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。
③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成 15 度左右。
⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为 4-10 微米。
⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min。
⑦切成的蜡带到 20-30cm 长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。
⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。
9. 展片、贴片
打开水浴锅,使水温维持在 40-45℃,另准备30% 乙醇溶液。
①
切片时,将一碗 30% 乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
②
用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在乙醇溶液的水面上,使切片展开。
③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开,用一个载玻片将切片完整,已展开的切片捞至温水中,使之充分展开。
④
另取洁净的载玻片,捞起展开的切片,使其位于切片 1/3 处,另一端(磨边,粗糙的一端)磨面上标记或贴上标签,放于切片架上。
10. 脱蜡复水
将水浴锅温度调至 60℃,待水温控制在60℃时,将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内,放入水浴锅中,盖上盖子(可密封),30min 至蜡熔化。
之后,石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各 5min,然后放入100%、95%、90%、80%、70% 各级酒精溶液中各3-5min,再放入蒸馏水中3min。
11. 染色
切片放入苏木精中染色约10-30min。
染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12.水洗
用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可),但要注意流水不能过大,以防切片脱落。
13.分化
将切片放入 1% 盐酸乙醇液中褪色,约 2 秒至数十秒钟。见切片变红,颜色较浅即可。