原位杂交实验方法和原理

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1 探针的设计与合成

1)    根据实验室已有的 p8 基因 cDNA 全长序列,用 premier primer5.0 设计引物 p81p82,以卤虫 cDNA 为模板,PCR扩增得到 346bp 的产物,用 Takara 胶回收试剂盒回收纯化。

引物编号

引物序列

长度

p81

TGCGGACGAAACAGGAAG

18 bp

p82

GCTCAAACAGTGATGCCAGT

20 bp

2)    目的片段克隆

a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分,载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下:

目的 PCR 片段                    5 μl

pGM-T载体(约50ng/uL         1 μl

10×T4
DNA Ligation Buffer         1 μl

T4 DNA Ligase3U/uL           1 μl

无菌去离子水                     3 μl

总体积                           10 μl

b. 轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。置于 PCR 仪中 16 过夜连接,反应结束后将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入 16 μlIPTG50mg/ml)、40 μlX-gal20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于37 培养箱 1-3 小时,使溶解 X-gal 的二甲基甲酰挥发干净。

d. 10 μl 的连接产物加到 100 μl DH5a 感受态细胞中,轻弹混匀,冰浴半小时,将离心管置于 42 水浴 90 秒,取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分钟,其间不要摇动离心管。向离心管加入 500 μl 37 预热的 LB(不含抗生素)培养基,150rpm摇床 37 振荡培养 45 分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。将菌液于 4000g 下离心 10 分钟,去掉上清,加入 100 μl 培养液重溶并加入到配制好的 LB 固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后,倒置平板,37培养 12-16 小时。

e. 挑取白色菌落直接进行 PCR 检测,筛选转化子。

f. 将转化子接种于 LB 液体培养基中培养 24 小时,吸取 1mL 菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。

3)    重组质粒的线性化

6 μl 以测序的重组质粒,选取 NcoI 内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl

质粒            6 μl

10xK Buffer     2 μl

NcoI          1 μl

0.1% BSA       2 μl

灭菌水          9 μl

终体积          20 μl

取酶切前后的质粒各 4 μl,经1% 琼脂糖电泳检测,确认酶切完全,将酶切产物用 Takara 胶回收试剂盒回收纯化,作为探针合成的模板。

4)    探针合成

按罗氏 DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) 试剂盒使用指南,标记反义 RNA 探针。

使用的所有试剂和器皿均经去 RNase 处理,合成方法如下 : 先准备反应体系。冰上向 RNase-Free 的微离心管中顺序加入下列试剂:

纯化的线形质粒              1 μg

Rnase-free dH2O                   up to 13 μl

10xNTP labeling mixture        2 μl

10xTranscription buffer         2 μl

Rnase inhibitor                1 μl

SP6 RNA Polymerase           2 μl

总体积                          20 μl

稍混匀,短暂离心将反应液集于管底,372 h。反应结束后再补加 2 μl DNase I37 15 min,反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取 3-5 μl 反应产物 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。-20℃保存备用。

2. 石蜡切片的制备

◆本实验在杂交结束前均必须保证 RNase-free. 玻璃器皿采用 180 烘烤 10 小时。其它采用 DEPC 处理,高温灭菌锅高温降解 DEPC。若仪器不能高温处理,可用3%H2O2处理半小时以上,DEPC水冲洗干净,烘干。

1)    组织的固定与包埋

选取不同发育时期(0h5h10h15h20h40h3d5d7d)的卤虫,经 DEPC 处理水冲洗表面盐分后,加入新鲜配制的 4% 多聚甲醛,于 4℃固定5-8 h,再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30% 乙醇脱水 1 h50% 乙醇脱水 1 h70% 乙醇脱水 1 h80% 乙醇脱水乙醇脱水 1 h90% 乙醇脱水1 h,无水乙醇脱水1 h,无水乙醇脱水1
h
,无水乙醇 : 二甲苯 (1:l) 透明 10 min,二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1) 浸蜡30 min54℃石蜡浸蜡1 h54℃石蜡包埋。

2)    组织切片:将包埋的组织按 7 μm 的厚度切片,在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加 DEPC 处理水,组织片于42<

正文完
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