B淋巴细胞分离技术

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一、实验原理

   膜表面免疫球蛋白 (SmIg),是B 细胞特有的表面标志,它既是 B 细胞识别抗原的受体,与相应抗原特异性结合;又是表面抗原,能与相应的抗 Ig 的抗体结合,故可用荧光标记的抗 Ig 抗体作免疫荧光镜检,以查出 B 淋巴细胞。由于 B 淋巴细胞在分化过程中最先出现 SmIg,所以该法可以检出全部B 淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现 IgM,以后相继出现IgGIgDIgA 等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌 A 蛋白 (SPA) 能与许多哺乳动物 IgGFc段发生结合,并且这种反应也发生于膜表面的 IgG,所以亦可以用荧光标记的SPA 菌体 (FITCSPA) 替代 FITCIgG检测 SmIg 阳性 B 淋巴细胞,凡于 FITCSPA 结合的细胞,在荧光显微镜下,可见到 B 淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体,即为 SmIg 阳性细胞即为 B 淋巴细胞。现将荧光标记 SPA 法介绍如下:

二、实验材料

1 冻干荧光金黄色葡萄球菌 A 蛋白 (FITCSPA) 菌体试剂,用时按要求稀释。

2
pH
72 Hanks 液,含 5% 小牛血清。

3 淋巴细胞分层液,20时比重为1077±0002

4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片

三、实验步骤

1、取肝素抗凝血 2ml,用Hanks 液稀释 12 倍,轻轻加入到装有 3ml 淋巴细胞分层液的试管中,20002500
r/min
水平离心2025min,获取淋巴细胞。

2、用 pH7.2Hanks液洗 2 次,最终配成细胞数为 225×106/ml 的淋巴细胞悬液。用 pH72Hanks液稀释 FITCSPA 菌体试剂,然后将淋巴细胞液与等量的 FITCSPA 菌体悬液混合,充分混匀后,放 4 冰箱30min

3、再用经 37 预热的 Hanks(5% 小牛血清 ) 洗涤离心

4、取沉淀细胞滴加在载玻片上,覆以盖玻片,在荧光显微镜下观察。

四、结果观察

凡淋巴细胞表面粘附 5 个以上菌体细胞为 SmIg 阳性。一般先用暗视野计算荧光阳性细胞数,继用明视野计算同一视野中淋巴细胞总数。每份标本至少计算 200 个淋巴细胞,并求出荧光阳性细胞百分率,同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算 B 淋巴细胞的绝对值。同时,每个 B 淋巴细胞表面可带有不同类别的 Ig,即IgMIgGIgA 等,如果分别用单价荧光抗 Ig 血清染色,则可鉴定不同 IgB淋巴细胞。但淋巴细胞数量的多少会影响检出率。过多或过少时,除难以计数外,染色背景明暗不匀,着色与不着色的细胞难以区别,一般以 225×106/ml 细胞浓度为宜,活细胞数应不少于95%

五、实验分析

此法特异性强,荧光亮度好,操作迅速简便。加上试剂有商品供应,可以使本法标准化。

一般 SmIg 阳性的 B 淋巴细胞表面或周围均可布满许多黄绿色荧光菌体,很少见到表面只粘附 23 个菌体细胞同时,每个 B 淋巴细胞表面可带有不同类别的 Ig,即IgMIgGIgA 等,如果分别用单价荧光抗 Ig 血清染色,则可鉴定不同 IgB淋巴细胞。

淋巴细胞数量的多少会影响检出率。过多或过少时,除难以计数外,染色背景明暗不匀,着色与不着色的细胞难以区别,一般以 225×106/ml 细胞浓度为宜,活细胞数应不少于95%

实验注意事项

SmIg 抗体发生结合时,由于抗血清为双价,使 SmIg 出现交联现象,这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状,时间过长,帽状结合物可脱落或被吞饮而消失,因此染色后,观察时间不能超过30min,或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。 

在滴片前要彻底去除游离的抗体,以避免假阳性结果

备注

异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体,其中异构体 型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为 389.4,最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长为520530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC 在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

 

正文完
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