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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑 (1) 细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用 Ficoll 密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
(一) 原理:
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是
1.077±0.001 的 聚
蔗糖 (Ficoll)- 泛影葡胺(Urografin)(F/H) 分层液。Ficoll 是蔗糖的多聚体，呈中性，犌 W 水性高，平均分子量为 400,000，当密度为 1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压, 也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
(二) 方法:
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量 Hank’s 液或 RPMI1640 充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心 2000rpm×20 分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和 Hank’s 液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的 Hank’s 液或 RPMI1640，1500rpm×10 分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有 10%小牛血清的 RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴 0.2%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数/1 毫升细胞悬液)=
4 个大方格内细胞总数
────────── × 104×2(稀释倍数)
4
6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数 200 个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率=────── ×100%
总细胞数
用本法分离 PBMC，纯度在 90%以上，收获率可达 80～90%，活细胞百分率在 95%以上。
(三) 试剂和材料:
比重 1.077±0.001 的聚蔗糖 - 泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
Hank’s 液(无 Ca2+、Mg2+)
10%小牛血清 RPMI1640
0.2%台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的 PBS 配制。
肝素用 Hank’s 液或生理盐水稀释成 500 单位/ml，牽 9 凝人外周血肝素用量约为 50 单位/1 毫升血。
短中管、毛细滴管、1 毫升和 10 毫升刻度吸管。
无菌干燥注射器针头。
碘酒，75%酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
血球计数板、显微镜、水平式离心机。
(四) 注意事项:
1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离 PBMC 时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛 & 配制相应密度的 Percoll 或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
(五) 附录
1. Hank’s 液 (无 Ca2+、Mg2+) 配制法
NaCl
8.0 克
KCl 0.4 克
Na2HPO4·12H2O 0.12 克
KH2HPO4
0.06 克
葡萄糖 1.0 克
双蒸水
1000 毫克
1%酚红液
2 毫克
将上列成分混合后溶化，分装于 500 毫升盐水瓶内，8 磅 15 分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调 PH 至 7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9%聚蔗糖 24 份
34%泛影葡胺
10%
混合，测比重为 1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液(PB)
原液:
A 液:
0.2M NaH2PO4溶液
NaH2PO4 27.6 克
或 NaH2PO4·2H2O
31.2 克
蒸馏水 溶解至 1000 毫升
B 液：0.2M Ha2HPO4溶液
Ha2HPO4·12H2O 71.6 克
蒸馏水溶解至 1000 毫升
各种不同 PH 值 PB 的配法
───────────────────────────────────────
PH 7.0
7.2 7.4
7.6 7.8
8.0
───────────────────────────────────────
A 液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B 液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
举例:
0.1M PH7.2PB
A 液 28 毫升
B 液 72 毫升
加蒸馏水
100ml
4. 血球保存液
葡萄糖 2.05 克 枸椽酸钠 0.8 克
氯化钠 0.42 克 蒸馏水
100 毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100 毫升)。经 10 磅、10 分钟高压灭菌。4℃保存备用。
5. RPMI-1640 培养液:
RPMT-1640(FLOW 公司出品) 1 袋
三蒸水
1000 毫升
电磁搅拌 30 分钟：1N HCl 调 PH7.2～7.4(约加 2.5 毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
不完全 RPMI-1640 培养液:
RPMI-1640 95 毫升
0.1M 丙酮酸钠 1 毫升
0.2M 谷氨酰胺 1 毫升
1M Hepes 1 毫升
7.5% NaHCO3
1 毫升
青霉素、链霉素(各 1 万单位) 1 毫升
完全 RPMI-1640 培养液
不完全 1640 培养液 90 毫升
灭活胎牛 (或新生牛) 血清
10 毫升
