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碱裂解法提取质粒DNA
细菌质粒 是一类双链、闭环的 DNA，大小范围从1kb~200kb 以上不等。存在于细胞之中，独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分。
碱裂解法 是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的一种方法，它利用染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异来达到分离的目的。其基本原理为：当菌体在 NaOH 和SDS溶液中（PH12.6）裂解时，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒 DNA 的氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补连不会完全打开，当加入 KAc（PH4.8）中和后，质粒DNA 分子能够迅速复性，成溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体 DNA 难于复性而成絮状，离心时可与细胞碎片一起沉淀下来。
试剂：
1.溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖 （使悬浮的大肠杆菌不会快速沉积到底部，其次调节渗透压）
25 mmol/L Tris.HCl (PH8.0) (缓冲体系)
10 mmol/L EDTA （PH8.0）(Ca离子、Mg离子等二价阳离子的螯合剂，抑制DNase
活性)
2.溶液 II: 使用前临时配制
0.2 mmol/L NaOH (溶解细胞)
1% SDS （使细胞膜崩解）
与此同时，提高溶液PH，使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。
3.溶液III：100mL
5mol/LKAc
60mL (Na被 K 置换成十二烷基磺酸钾 PDS，PDS 结合蛋白质沉淀，同时牵连染色体发生沉淀)
冰醋酸 11.5 mL（中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA 一旦发生断裂，只要是 50-100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了）
ddH2O 28.5 mL
注意：
① NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。要新从浓NaOH 稀释制备 0.2M 的NaOH，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性。
②溶液 II 处理这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。
③溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的纳离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，其次大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给合共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。
④PDS沉淀的形成不能能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 / 氯仿 / 异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase 而发生降解。
操作步骤：
1. 挑取 LB 培养基上生长的单菌落，接种于 3.0mL 含Amp的 LB 液体培养基中，37℃，250rmp震荡培养 12~16 小时。
2. 取 1.5mL 细菌培养液于灭菌 EP 管中，4℃，6000rmp离心10min，弃上清，使液体尽量控干。
3. 将沉淀悬于 250μl 溶液 I 中，室温静置2min。
4. 加入 250μl 溶液II，颠倒混匀，不要剧烈震荡，常温静置5min。
5. 加入 250μl 预冷的溶液III，颠倒混匀，置于冰上放置10min，
6. 4℃，14000rpm，离心 10min，将上清转入新的灭菌EP 管中。
7. 加入等体积的酚 / 氯仿 / 异戊醇，震荡混匀5min。
8. 4℃，14000rpm，离心 10min，小心吸出上层水相，转移另一干净EP 管中。
9. 加入 1 倍体积的异丙醇，混匀后冰上静置20min。
10. 4℃，14000rpm，离心 10min, 弃上清，加入 0.5mL ，70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。（不要把沉淀弄碎）
11. 10000rmp，离心2min，弃上清。将沉淀在室温下晾干。
12. 将沉淀于 20μlTE（含RNase）中，37℃保温0.5~1h 后-20℃保存。
