基因表达质粒载体构建流程手册

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一：pMind-AAA的构建

Mycobacterium smegmatis str. MC2
155, complete genome

GenBank: CP001663.1

1：设计合成 AAA 引物

Forward primer :  CCATATGAGCAAGCAGATTGAATTCAACG(NdeⅠ,29bp,Tm 59℃,)

Reverse primer :  TACGCGTGTGAAATGGATCAGTGAGC (MluⅠ,26bp,Tm 60℃)

2：M.smeg AAA 基因的扩增
   (1)：PCR反应
       以 M.smeg genomic DNA 为模板 , 进行 PCR 扩增
   (2)：PCR产物回收纯化

3：pJET-Ms AAA 的构建
   (1)：连接转化：将上述回收的 PCR 产物与 pJET 载体连接 , 转化至 NovaBlue 菌株
   (2)：重组质粒提取鉴定：挑取单菌落，过夜培养，提取重组质粒，酶切鉴定
   (3)：Ms AAA 测序

4：pMind-AAA构建
   (1)：用 NdeⅠ、MluⅠ酶切 pMind 和 pJET-AAA 质粒，切胶回收载体和目的片段，
       连接，转化至 NovaBlue 菌株
   (2)：重组质粒提取，酶切鉴定

5：pMind-AAA在 M.smeg 中构建
  (1)：M.smeg感受态细胞的制备
  (2)：电转化：将 pMind-AAA 质粒电转至 M.smeg 菌株中

6：Ms AAA在 M.meg 中的表达与纯化
  (1)：挑取单菌落，培养，经四环素 (Tc) 诱导表达 Ms AAA 蛋白表达，
          SDS-PAGE、Western Blot确定最佳诱导条件。
  (2)：Ni⁺-NTA亲和层析纯化 Ms AAA 蛋白 ,SDS-PAGE 检测纯化蛋白纯度