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肿瘤细胞侵袭实验（Tumour InvasionA ssay）
目的：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。
实验方法
实验方法原理
Matrigel 基质膜模型
Matrigel 是从小鼠 EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有 LN、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在 DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
滤膜孔径一般为 8um，而且膜孔都被 Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有 Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
铺有 Martrigel 的滤膜放在以 Blind Well 腔或 MICS 腔上下室之间，铺有 Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的 LN、FN 或小鼠 3T3 条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与 Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16 小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过 Martrigel 的细胞数。另外用 Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在 Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上 30ugMartrigel，加入细胞 72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在 TransWll 腔中培养 72 小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。
在上述分析中，如果不在膜上铺 Martrigel 而直接将 8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有 LN 或 FN 或在滤膜下表面铺上 LN 或 FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。
实验材料
目的：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。
实验方法
实验方法原理
Matrigel 基质膜模型
Matrigel 是从小鼠 EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有 LN、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在 DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
滤膜孔径一般为 8um，而且膜孔都被 Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有 Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
铺有 Martrigel 的滤膜放在以 Blind Well 腔或 MICS 腔上下室之间，铺有 Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的 LN、FN 或小鼠 3T3 条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与 Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16 小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过 Martrigel 的细胞数。另外用 Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在 Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上 30ugMartrigel，加入细胞 72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在 TransWll 腔中培养 72 小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。
在上述分析中，如果不在膜上铺 Martrigel 而直接将 8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有 LN 或 FN 或在滤膜下表面铺上 LN 或 FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。
实验材料
Matrigel 基质胶
试剂、试剂盒
DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清 DMEM 培养基 FBS-DMEM 培养基 IFN-γ
仪器、耗材
24-transwell (Coster) 离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒
实验步骤
一、溶液配制
1. DMEM
（1）NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）
（2）母液 0.1 ml（5 mg）+ ddH2O up to 5 ml；过滤消毒，-20℃保存。
2. NE-DMEM（-6 M）
NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）20.5 μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
3. NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng）
（1）NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）20.5 μl
（2）CGRP- 储存液 50 μl
（3）DMEM UP TO 100 ml
（4）过滤消毒，4℃保存
4. NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng）
（1）NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）20.5 μl
（2）IFN-γ（25ng/μl）25 μl
（3）DMEM UP TO 100 ml
（4）过滤消毒，4℃保存。
5. 低血清 DMEM 培养基（上室）
6. 20%FBS-DMEM 培养基（下室）
试剂、试剂盒
DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清 DMEM 培养基 FBS-DMEM 培养基 IFN-γ
仪器、耗材
24-transwell (Coster) 离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒
实验步骤
一、溶液配制
1. DMEM
（1）NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）
（2）母液 0.1 ml（5 mg）+ ddH2O up to 5 ml；过滤消毒，-20℃保存。
2. NE-DMEM（-6 M）
NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）20.5 μl
DMEM UP TO 100 ml
过滤消毒，4℃保存
3. NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng）
（1）NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）20.5 μl
（2）CGRP- 储存液 50 μl
（3）DMEM UP TO 100 ml
（4）过滤消毒，4℃保存
4. NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng）
（1）NE—A 液（1 μg/μl，1 mg/ml）20.5 μl
（2）IFN-γ（25ng/μl）25 μl
（3）DMEM UP TO 100 ml
（4）过滤消毒，4℃保存。
5. 低血清 DMEM 培养基（上室）
6. 20%FBS-DMEM 培养基（下室）
7. Matrigel 基质胶
（1）10 mg/ml，5 ml，分装成 0.5 ml/ 只 10 个 EP 管中。
（2）用时加入 0.5 ml 的 DMEM。
（3）Matrivgel 在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。
二、准备
1. 溶胶，4℃过夜。
2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤 2 和 3 种使用试管和枪头要在试验前 -20C 预冷。
三、包被基底膜（冰上操作）
1. 用无血清的冷细胞培养基 DMEM 稀释 Matrigel 胶。
2. 取 100 ul 稀释胶加到 24-well transwell 上室中。
3. 37℃孵育 transwell 至少 4 -5 h。
四、水化基底膜
1. 用无血清培养基轻洗凝胶。
五、准备细胞悬液和小室
1. 消化法从细胞培养瓶中获取细胞。
2. 用培养基洗 3 遍。
3. 重悬细胞，5×105 cells/ml，1% FBS。
4. 上室加 200 ul 细胞悬液。
5. 下室中加入 600 ul 细胞培养基，含有 5 ug/ml fibronectin 作为黏连亚族。
六、孵育
二、准备
1. 溶胶，4℃过夜。
2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤 2 和 3 种使用试管和枪头要在试验前 -20C 预冷。
三、包被基底膜（冰上操作）
1. 用无血清的冷细胞培养基 DMEM 稀释 Matrigel 胶。
2. 取 100 ul 稀释胶加到 24-well transwell 上室中。
3. 37℃孵育 transwell 至少 4 -5 h。
四、水化基底膜
1. 用无血清培养基轻洗凝胶。
五、准备细胞悬液和小室
1. 消化法从细胞培养瓶中获取细胞。
2. 用培养基洗 3 遍。
3. 重悬细胞，5×105 cells/ml，1% FBS。
4. 上室加 200 ul 细胞悬液。
5. 下室中加入 600 ul 细胞培养基，含有 5 ug/ml fibronectin 作为黏连亚族。
六、孵育
37℃，20 to 24 h。
七、染色和计数
1. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。
2. 移去 transwells，倒置，风干。
3. 24 孔板中加入 500 μl 含 0.1% 结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 30min 后取出，PBS 清洗。
4. 直径上取 4 个视野，照相，计数。
5. 24 孔板中加入 500 μl 33% 醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡 10 min，充分溶解。取出小室，24 孔板于酶标仪上 570nm 测 OD 值，间接反应细胞数。
展开
注意事项
1. 照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。
七、染色和计数
1. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。
2. 移去 transwells，倒置，风干。
3. 24 孔板中加入 500 μl 含 0.1% 结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 30min 后取出，PBS 清洗。
4. 直径上取 4 个视野，照相，计数。
5. 24 孔板中加入 500 μl 33% 醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡 10 min，充分溶解。取出小室，24 孔板于酶标仪上 570nm 测 OD 值，间接反应细胞数。
展开
注意事项
1. 照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。
2. 使用 Matrivgel 前应从 -20℃转移至 4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。
3. 使用时需接触 Matrivgel 的试管、移液吸头等均应预冷于 4℃。
4. 使用 Matrivgel 时注意无菌操作。
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正文完
