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载体主要有病毒和非病毒两大类, 其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素
? 复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
? 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+
,Kan+
? 多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段
? P/E 启动子 / 增强子
? Terms 终止信号
? 加 poly（A）信号 可以起到稳定 mRNA 作用
二、如何阅读质粒图谱
第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核 / 真核 / 穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解 β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素 β 失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
? 启动子-促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
? 增强子 / 沉默子-为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/ 沉默子-负增强子，负调控序列。
? 核糖体结合位点 / 起始密码 /SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。
? 转录终止顺序（终止子）/ 翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。
回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.
三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）
1. 什么是载体
即要把一个有用的基因（目的基因?? 研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S. 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA
2. 载体的分类
———按功能分成：（1）克隆载体 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）
（2）表达载体 具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录 / 翻译所必需的 DNA 顺序的载体。
———按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
3. 基因工程载体的 3 个特点：
（一）都能独立自主的复制：载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如 MCS，插在其中的外源 DNA 片段，能被动的跟着载体一起复制 / 扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述 3 点：
【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增 / 表达表达，选择合适的克隆载体 / 表达载体。
【2】. 载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小（大选大，小选小）。如 <10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型-原核 / 真核 / 穿梭，E.coli/ 哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意 3 点：
①选择合适的启动子及相应的受体菌；
②用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位；
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的 4 点要求：
①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒 <10 个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
一 . 九种表达载体
Pllp-OmpA,pllp-STII,pMBP-P,pMBP-C,
pET-GST,pET-Trx,pET-His,pET-CKS,pET-DsbA
二 . 克隆载体
pTZ19RDNA
pUC57DNA
PMD18T
PQE30
pUC18
pUC19
pTrcHisA
pTrxFus
pRSET-A
pRSET-B
pVAX1
PBR322
pbv220
pBluescriptIIKS()
L4440
pCAMBIA-1301
pMAL-p2X
pGD926
三 .PET 系列表达载体
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44
ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA
ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits
四 .PGEX 系列表达载体
TEcoR?pGEX-1I/BAP
pGEX-2T
pGEX-2TK
pGEX-3X
pGEX-4T-1
pGEX-4T-2
pGEX-4T-3
pGEX-5X-1
pGEX-5X-2
pGEX-5X-3
pGEX-6P-1
pGEX-6P-2
pGEX-6P-3
五.PTYBsystem
PTYB1
PTYB2
PTYB11
PTYB12
六 . 真核表达载体
pCDNA3.1(-)
pCDNA3.1()
pPICZalphaA
pGAPZαA
PYES2.0
pBI121
pEGFP-N1
pEGFP-C1
pPIC9K
pPIC3.5K
